Professor Layton en de eeuwige Diva - Layton ontvangt een uitnodiging van de beroemde operazangeres Jenice Kaitly, waarin ze uitgenodigd wordt om haar nieuwste show bij te wonen. Ook vraagt ze de hulp van Layton, Luke en Remi om haar te helpen met een mysterie; haar vriendin Melina verdween een jaar geleden, maar keerde terug als een 7-jarig meisje. Ze vertelde dat ze het geheim van het eeuwige leven had gevonden. Layton en de rest kunnen niet wachten dit mysterie te onderzoeken, dus begeven ze zich naar de 'Crown Petone', waar de opera plaatsvindt. Als ze aankomen wordt hen al snel iets vreemds verteld door de pianist Ozro Vislar; volgens hem is er een spelletje waarbij de winnaar het eeuwige leven ontvangt. Layton en de rest zullen dit mysterie nu op moeten lossen.